1.) First-Strand cDNA Synthese
Poly(A) RNA einer Gesamt-RNA Probe wird in 1st-Strand cDNA umgeschrieben. Für diese Reaktion werden Oligo(dT) Primer (mit einer T7 RNA Polymerase-Erkennungssequenz am 5'-Ende) eingesetzt. Die Erststrang cDNA Synthese erfolgt mit der SuperScript III Reverse Transcriptase (nicht im Kit enthalten) bei erhöhter Temperatur, um RNA Sekundärstrukturen zu reduzieren.
2.) Second-Strand cDNA Synthese
Die RNA des cDNA:RNA Hybrids wird durch RNase H in kleine RNA Fragmente verdaut. Diese RNA Fragmente dienen als Primer für die 2nd-Strand cDNA Synthese. Die resultierende doppelsträngige cDNA enthält einen T7 Promotor, um bei der anschließenden in vitro Transkription eine Antisense RNA (aRNA, auch als cRNA bezeichnet) zu erzeugen. Eine Aufreinigung der in diesem Schritt erzeugten cDNA vor der in vitro Transkription ist nicht notwendig.
3.) In vitro Transkription der aRNA (Aminoallyl-aRNA)
Ausgehend von der doppelsträngigen cDNA (aus Schritt 2) werden hohe Ausbeuten an aRNA (oder Aminoallyl-aRNA) während einer schnellen in vitro Transkriptionsreaktion produziert.
4.) Aufreinigung der aRNA (Aminoallyl-aRNA)
Die Aufreinigung der aRNA (Aminoallyl-aRNA) aus Schritt 3 erfolgt über einen Chromatographieschritt mittels Minispin-Säulen (nicht im Kit enthalten)
Die TargetAmp 1-Round Amplifikation ist hiermit beendet. Für die TargetAmp 2-Round Amplifikation werden noch die Schritte 5 – 8 durchgeführt.
5.) Runde 2, 1st-Strand cDNA Synthese
Die gereinigte aRNA aus der ersten Amplifikationsrunde wird mit Hilfe der SuperScript II Reverse Transcriptase in 1st-Strand cDNA umgeschrieben. Als Primer kommen hierbei Random Hexamer Oligos zum Einsatz.
6.) Runde 2, 2nd-Strand cDNA Synthese
Die RNA des cDNA:RNA Hybrids aus Schritt 5 wird durch RNase H in kleine Fragmente verdaut. Als Primer für die 2nd-Strand cDNA Synthese dienen T7-Oligo(dT) Primer. Die resultierende doppelsträngige cDNA enthält einen T7 Promotor, um bei der anschließenden in vitro Transkription eine Antisense RNA zu erzeugen.
7.) Runde 2, in vitro Transkription der aRNA (Aminoallyl-aRNA)
Ausgehend von der doppelsträngigen cDNA (aus Schritt 6) werden hohe Ausbeuten an aRNA (oder Aminoallyl-aRNA) während der in vitro Transkriptionsreaktion produziert.
8.) Runde 2, Aufreinigung der aRNA (Aminoallyl-aRNA)
Die Aufreinigung der aRNA (Aminoallyl-aRNA) aus Schritt 3 erfolgt über einen Chromatographieschritt mittels Minispin-Säulen (nicht im Kit enthalten).
Zeitbedarf für TargetAmp 1-Round bzw. TargetAmp 2-Round RNA Amplifikations-Kits
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TargetAmp 1-Round Kits
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TargetAmp 2-Round Kits
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Runde 1
1st-Strand cDNA Synthese
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35 Minuten
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35 Minuten
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Runde 1
2nd-Strand cDNA Synthese
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13 Minuten
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26 Minuten
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Runde 1
In vitro Transkription
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4 Stunden, 15 Minuten
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4 Stunden, 15 Minuten
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Runde 1
aRNA (Aminoallyl-aRNA) Aufreinigung
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ca. 30 Minuten
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ca. 30 Minuten
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Runde 2
1st-Strand cDNA Synthese
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1 Stunde, 37 Minuten
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Runde 2
2nd-Strand cDNA Synthese
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28 Minuten
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Runde 2
In vitro Transkription
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9 Stunden, 15 Minuten
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Runde 2
aRNA (Aminoallyl-aRNA) Aufreinigung
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ca. 30 Minuten
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Gesamtzeitbedarf
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5 Stunden, 30 Minuten
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17 Stunden, 30 Minuten
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