Zellfreie Proteinsynthese – Schnell, flexibel, skalierbar
Die zellfreie Proteinsynthese bietet viele Vorteile, die sie zu einem wertvollen Tool in der Forschung macht. Ein besonderer Vorteil liegt in der nur wenige Stunden dauernden Synthese der Proteine im zellfreien System. So können beispielsweise potenzielle Wirkstoffe und Kandidatenmoleküle deutlich schneller getestet werden. Erfahren Sie mehr über das zellfreie System zur Proteinsynthese und das Rapid Translation System!
Warum Zellfreie Proteinsynthese im Labor nutzen?
Wie funktioniert die zellfreie Proteinsynthese?
- Template wählen: DNA- oder mRNA
- System auswählen: Prokaryotische oder eukaryotische CFPS-Plattform – passend zur Zielproteinklasse.
- Reaktionsbedingungen anpassen: Reaktionszeit, Puffer, Energiequelle, Cofaktoren
Wo wird das zellfreie System zur Proteinsynthese eingesetzt?
Die schnelle zellfreie Proteinsynthese bietet zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten in verschiedenen Bereichen. In der Strukturbiologie können schnell Proben für NMR und X-Ray Kristallographie hergestellt werden, was die Forschung beschleunigt. Für die Grundlagenforschung ermöglichen einfache Modifikationen des gewünschten Proteins weiterführende Studien. In therapeutischen Vorstudien können Proof-of-Concept-Tests sowie Stabilitäts- und Formulierungstests in frühen Phasen effizient durchgeführt werden. Darüber hinaus ist das System auch für die Diagnostik-Entwicklung von Bedeutung, da es die Herstellung von Standards sowie Antikörper- und Enzym-Modellen im CECF-Format ermöglicht.
Rapid Translation Systems (RTS)
Mit den Produkten von biotechrabbit bietet Biozym zellfreie Expressionskits für die Synthese einer breiten Palette von Proteinen für Screening, Charakterisierungsstudien, Funktionsassays oder Strukturanalysen. Die Plattform verwendet Zelllysate unterschiedlicher Herkunft und ermöglicht eine skalierbare In-vitro-Proteinexpression mit einzigartigen patentierten Merkmalen. Dadurch werden außergewöhnlich hohe Proteinausbeuten von bis zu 6 mg/ml zu erzielt.
Was sind Rapid Translations Systeme und wofür werden diese eingesetzt?
Rapid Translation Systeme (RTS) ermöglichen die schnelle, flexible und zellfreie Herstellung funktioneller Proteine – von dem DNA-Template bis zum einsatzbereiten Protein in wenigen Stunden.
Ausgehend von einer DNA-Vorlage ermöglichen RTS die In-vitro-Proteinsynthese mit Ausbeuten von wenigen Mikrogramm bis 6 Milligramm pro Milliliter. Je nach Anwendung können lineare oder zirkuläre DNA-Templates eingesetzt werden. Spezialisierte Kits unterstützen zudem die Herstellung von Proteinen mit Disulfidbrücken oder bestimmten posttranslationalen Modifikationen wie z.B. Glykosylierung. Ergänzende Systeme ermöglichen die Generierung geeigneter DNA-Templates.
Die Vorteile von RTS:
- Expression verschiedener Proteinklassen
- Kontinuierlicher Austausch während der zellfreien Expression (CECF) für Ausbeuten von bis zu 6 mg/ml
- Verbesserte Pufferzusammensetzungen für hohe Ausbeute (HY)
- Kompatibel mit T7-Expressionsvektoren
Hinweis: Die erreichbaren Ausbeuten und die Möglichkeit, bestimmte posttranslationale Modifikationen einzuführen, hängen vom jeweiligen RTS-System und dessen Reaktionschemie ab. Nicht jedes zellfreie System unterstützt automatisch alle Modifikationen.
Das passende Rapid Translation System bei Biozym kaufen
Das Rapid Translation System ist für eine große Bandbreite an Proteinnarten (Lösliches Proteine, Membranproteine, Proteine mit Disulfidbrücken, Antikörperfragmente, glykosyliertes Proteine) geeignet. Hier finden Sie das richtige Kit:
| Cell-free synthesis kit |
Reaction yield |
Reaction volume |
Reaction time (hrs) |
Expression template |
Expression mode |
Protein classes expressed |
| RTS 100 E. coli HY Kit | 20 μg | 50 μl | 1–4 | Linear: 1, 3, 4 Vector: 6, 8 |
Batch | Standard soluble Membrane |
| RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit |
6 mg | 1 ml | 6–24 | Vector: 6, 8 | CECF | Standard soluble Membrane |
| RTS 9000 E. coli HY Kit | 50 mg | 10 ml | 6–24 | Vector: 6, 8 | CECF | Standard soluble Membrane |
| RTS 100 E. coli Disulfide Kit | 80 μg | 50 μl | 6–24 | Vector: 6, 8 | CECF | Standard soluble, Disulfide- bonded, (Fab antibodies) |
| RTS 500 E. coli Disulfide Kit | 2.5 mg | 1 ml | 6–24 | Vector: 6, 8 | CECF | Standard soluble,Disulfide- bonded, (Fab antibodies) |
| RTS 100 Wheat Germ Kit | 5 μg | 50 μl | 3 | Linear: 2 Vector: 7 |
Batch | Complex and large ,Standard Membrane |
| RTS 100 Wheat Germ CECF Kit | 50 μg | 50 μl | 6–24 | Linear: 2 Vector: 7 |
CECF | Complex and large, Standard Membrane |
| RTS 500 Wheat Germ CECF Kit | 1 mg | 1 ml | 6–24 | Linear: 2 Vector: 7 |
CECF | Complex and large, Standard Membrane |
| RTS 100 Insect Membrane Kit | 2 μg | 50 μl | 4 | Linear: 1, 3, 4 Vector: 5, 6, 8 |
Batch | Complex and large, Standard Membrane |
Übersicht der entsprechenden linearen Templates und Vektoren für die zellfreie Protein Synthese:
|
No. |
PCR generated linear template |
Protein tag |
|
1 |
RTS Linear Template Kit Plus |
His-tag, Strep-tag, Signal peptide |
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2 |
RTS Wheat Germ LinTempGen Set, His6-tag |
His-tag |
|
3 |
RTS Linear Template Fab Kit |
His-tag, Signal peptide |
|
4 |
RTS 100 E. coli LinTempGen Set, His-tag |
His-tag |
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No |
T7 vectors for cloning genes or linear templates |
Protein tag |
|
5 |
RTS pIX4.0 Insect Vector |
Tag from cloned gene |
|
6 |
RTS pIX3.0 Vector |
Tag from linear template |
|
7 |
RTS pIVEX Wheat Germ His6-tag Vector Set |
His-tag |
|
8 |
RTS pIVEX E. coli His-tag, 2nd Gen. Vector Set |
His-tag |
Vergleich der Batch-Methode und CECF-Methode (Continuous Exchange Cell-free Technology)
Batch-Methode
Die Batch-Methode wird häufig für schnelles Screening, Optimierung und die parallele Expression von Varianten eingesetzt. Sie nutzt zellfreie Expressionssysteme, die alle notwendigen Komponenten der Proteinsynthese wie Lysat und Aminosäuren enthalten. Durch die Abwesenheit von Zellkern, Mitochondrien, bestehender mRNA und Zytoskelett, wird nur eine vom Forscher eingebrachte DNA/mRNA als Template genutzt. Die Inkubationszeit beträgt lediglich zwei bis vier Stunden.
Zellfreie Expressionssysteme enthalten:
- Alle Komponenten der Protein Expressionsmaschinerie (wie z.B.: Lysate, Aminosäuren etc.)
- Kein Zellkern, keine Mitochondrien, keine mRNA und kein Cytoskelett
- Nur eine mRNA: Gen-spezifisches Template
High Yield - CECF-Methode
Die Continuous‑Exchange‑Cell‑free‑Technology (CECF) ist dagegen auf hohe Protein‑Ausbeuten ausgelegt und kommt beispielsweise bei der Antigenproduktion, dem Labeling für NMR- oder Röntgenstrukturanalysen sowie bei funktionellen Tests zum Einsatz. Das System besteht aus zwei Kammern, die durch eine semipermeable Membran getrennt sind. So werden Substrate und Energie der Reaktion kontinuierlich zugeführt und inhibierende Nebenprodukte abgeführt. Dadurch kann die Reaktion bis zu 24 Stunden laufen, was zu einer deutlich höheren Ausbeute führt.
Schema von RTS CECF Systems
1a: DNA Template: Template wird in passenden Vektor mit T7 Promotor kloniert oder mittels PCR und den entsprechenden Primern (T7 Promotor, 5 ´UTR, Tag…) generiert
2a: In einer gekoppelten Reaktion wird die cDNA in mRNA umgeschrieben (Transkription) und anschließend in Protein „übersetzt“ (Translation)
1b: mRNA Template: wird vorher separat in einer IVT Reaktion transkribiert
2b: Die Translations-Maschinerie „übersetzt“ die mRNA in Protein
3. Das gewünschte Produkt akkumuliert in der Reaction chamber (bis zu 24)
FAQs: Häufig gestellte Fragen zum Thema zellfreie Proteinsynthese
Welche Geräte werden für RTS-Reaktionen benötigt?
Neben Standard Laborequipment wird noch ein Gerät mit Schüttel- und Heizfunktion benötigt. Für die Durchführung von RTS-Reaktionen (Rapid Translation System) im Labor ist neben dem Standard-Laborequipment noch ein Gerät mit Schüttel- und Heizfunktion erforderlich. Einen Thermomixer oder Thermoblock ermöglicht die präzise Temperaturkontrolle und gleichmäßiges Mischen der Proben, was für die Effizienz und Reproduzierbarkeit der Reaktionen entscheidend ist.
Wie kann die Löslichkeit von exprimierten Proteinen erhöht werden?
Die Löslichkeit von exprimierten Proteinen kann durch den gezielten Einsatz von Detergenzien und Chaperonen signifikant verbessert werden. Detergenzien wie Brij® 35, Brij® 78, Dodecylmaltosid (DDM), CHAPS und Sorbitol wirken als milden Tenside, die die Aggregation von Proteinen verhindern, indem sie hydrophobe Wechselwirkungen aufbrechen und die Proteine in lösliche Komplexe überführen. Zusätzlich können molekulare Chaperone wie DnaK, DnaJ und GrpE die korrekte Faltung und Löslichkeit von Proteinen fördern. Diese Chaperone binden an ungefaltete oder teilweise gefaltete Proteine und verhindern deren Aggregation, indem sie den Faltungsprozess unterstützen.
Was ist die zuverlässigste Methode zur Analyse der Proteinexpression?
Die zuverlässigste Methode zur Analyse der Proteinexpression kombiniert in der Regel SDS-PAGE mit Western Blotting. Funktionelle Assays ergänzen diese Methoden, indem sie die biologische Aktivität der Proteine untersuchen. Sie sind besonders nützlich, um die Auswirkungen von Mutationen oder posttranslationalen Modifikationen auf die Funktionalität eines Proteins zu bewerten.
