Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist eine grundlegende Technik in der Molekularbiologie, die zur Amplifikation und Quantifizierung von DNA verwendet wird. Die Echtzeit PCR (engl. realtime PCR) hat sich in den letzten Jahren als unverzichtbare Methode für die präzise Analyse von Nukleinsäuren etabliert und ist besonders in der klinischen Diagnostik gefragt. Hier erfahren Sie mehr über diese wichtige Applikation!
qPCR (quantitative Polymerase-Kettenreaktion)
Die qPCR, auch als quantitative realtime PCR (Echtzeit-PCR) bezeichnet, ist eine Weiterentwicklung der PCR, die es ermöglicht, die Menge einer bestimmten DNA-Sequenz quantitativ zu bestimmen. Sie wird häufig für die Genexpression, die Erkennung von Krankheitserregern und die Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren eingesetzt.
Quantitative Messung: Im Gegensatz zur herkömmlichen PCR liefert die qPCR quantitative Daten über die Anfangskonzentration der Ziel-DNA. Sie ermöglicht es, den genauen Gehalt eines spezifischen DNA-Fragments in der Probe zu bestimmen.
Fluoreszenzmarkierung: In der qPCR wird eine fluoreszierende Markierung verwendet, die sich während der Reaktion akkumuliert. Dies ermöglicht die kontinuierliche Überwachung der DNA-Amplifikation in Echtzeit. Die Auswahl zwischen interkalierenden Farbstoffen und Sonden hängt von den spezifischen Anforderungen der Experimente ab, wobei Sonden-basierte qPCR für spezifische Anwendungen bevorzugt wird, während interkalierende Farbstoffe für viele quantitativen PCR-Anwendungen ausreichend sein können.
Ct-Wert: Der Schwellenzykluswert (Ct-Wert) in der qPCR ist ein Maß für die Menge des Zielgens in der Probe. Je niedriger der Ct-Wert, desto höher ist die Ausgangskonzentration des Ziels.
Anwendungen: qPCR wird für die Quantifizierung von Genexpression, die Identifizierung von Krankheitserregern, die Analyse von Genkopienzahl und die Untersuchung von Genotypen verwendet. Sie ist besonders nützlich in der Forschung und der klinischen Diagnostik.
qPCR mit interkalierenden Farbstoffen
Bei der qPCR mit interkalierenden Farbstoffen wird ein fluoreszierender Farbstoff verwendet, der in den sich bildenden DNA-Doppelstrang eintritt. Je mehr DNA während der PCR amplifiziert wird, desto mehr Farbstoff wird gebunden, was zu einer erhöhten Fluoreszenz führt.
Anwendungen
Es gibt folgende Anwendungsgebiete für die qPCR mit interkalierenden Farbstoffen:
- Genexpressionanalyse
- Bestimmung von Genkopienzahlen
- Nachweis von pathogenen Mikroorganismen
Ablauf und Vorteile
Der Ablauf der quantitative realtime PCR mit interkalierenden Farbstoffen lässt sich wie folgt beschreiben:
- Schritt 1: Die DNA-Vorlage wird mit spezifischen Primern und dem interkalierenden Farbstoff gemischt.
- Schritt 2: Während der Temperaturzyklen der PCR binden die Primer an die Ziel-DNA, und die DNA wird amplifiziert.
- Schritt 3: Während der Elongationsphase bindet der interkalierende Farbstoff an die wachsende DNA-Kette.
- Schritt 4: Die Fluoreszenz wird in Echtzeit gemessen, wobei die Zunahme der Fluoreszenz mit der Anzahl der amplifizierten DNA-Kopien korreliert.
Die wesentlichen Vorteile der qPCR mit interkalierenden Farbstoffen auf einen Blick:
- Einfachere und kostengünstigere Methode als die Sonden-basierte qPCR.
- Gut geeignet für die Quantifizierung von DNA mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit.
qPCR mit Sonden
Bei der qPCR mit Sonden wird eine fluoreszierende Sonde verwendet, die spezifisch an die Ziel-DNA bindet. Während der Amplifikation setzt die Polymerase die Sonde frei, was zu einer Fluoreszenzsteigerung führt.
Anwendungen
Es gibt folgende Anwendungsgebiete für die qPCR mit Sonden:
- Genexpressionanalyse mit höchster Genauigkeit
- Quantitative Analyse von pathogenen Organismen und Viren
- Genotypisierung von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs)
Gut zu wissen: Die Auswahl zwischen interkalierenden Farbstoffen und Sonden hängt von den spezifischen Anforderungen der Experimente ab, wobei Sonden-basierte qPCR für hochspezifische Anwendungen bevorzugt wird, während interkalierende Farbstoffe für viele quantitativen realtime PCR-Anwendungen ausreichend sein können.
Ablauf und Vorteile
Wenn Sie sich für eine qPCR mit Sonden entscheiden, gehen Sie bei der Anwendung wie folgt vor:
- Schritt 1: Die DNA-Vorlage wird mit spezifischen Primern und einer fluoreszierenden Sonde gemischt.
- Schritt 2: Während der PCR binden die Primer an die Ziel-DNA und die Polymerase beginnt mit der Synthese.
- Schritt 3: Die Sonde, die mit einer Quenchergruppe versehen ist, wird während der Synthese der DNA durch die Polymerase zerstört. d. Die Freisetzung der Sonde führt zu einer messbaren Fluoreszenzsteigerung.
Das sind die Vorteile der quantitativen realtime PCR mit Sonden:
- Höchste Spezifität, da die Sonde nur bei korrektem Match an die Ziel-DNA bindet.
- Niedrigere Wahrscheinlichkeit für falsch-positive Ergebnisse.
Die Echtzeit PCR mit Sonden ist die bevorzugte Methode für Anwendungen, bei denen höchste Präzision und Spezifität erforderlich sind, wie etwa in der klinischen Diagnostik und der Virusdetektion.