In vitro Transkription (IVT)

Entdecken Sie die leistungsstarken Produkte für die in vitro Transkription von Biozym! Unsere Lösungen bieten höchste Qualität und Effizienz für Ihre Laborarbeit – ideal für präzise und zuverlässige RNA-Synthese. Mit bewährten Reagenzien und IVT Kits unterstützen wir Sie in jeder Phase des Transkriptionsprozesses und gewährleisten reproduzierbare Ergebnisse.

Anwendungsbereiche der in vitro Transkription

Bei der in vitro Transkription (auch IVT oder in vitro RNA Synthese) wird RNA anhand eines DNA-Templates außerhalb einer lebenden Zelle, synthetisiert.

Die Anwendungsbereiche der in vitro Transkription sind vielfältig und dienen unter anderem zur Herstellung von:

• RNA zur Translation in Zellen oder auch zur in vitro Translation
• siRNAs (small interfering RNAs)
• RNA-Sonden-Hybridisierungs Assays
• gRNA (guide RNA)-CRISPR
• RNaseA resistente RNA (z.B. zur Aptamer Synthese)

Biozym bietet Ihnen ein umfangreiches Portfolio an Produkten von renommierten Herstellern im Bereich der in vitro Transkription an. Dieses reicht von Einzelkomponenten bis hin zu vollständigen IVT Kit

IVT Kits von Biozym

Die T7-Flash™ Transcription Kits bzw. die T7 Flash Scribe Kits wurden speziell entwickelt, um eine maximal mögliche RNA-Ausbeute in einer in vitro Transkriptionsreaktion (IVT) in nur 30 Minuten zu erhalten. Unter Standard Reaktionsbedingungen (30 Minuten, 20 µl Reaktion, 1 µg Control Template) können bis zu 180 µg RNA hergestellt werden.
Die T7-Flash Kits produzieren auch außergewöhnlich hohe Ausbeuten an langen oder kurzen Transkripten. Für die Produktion von RNA-Mengen im Milligramm Bereich, kann die Standardreaktion einfach skaliert werden. Das IVT Kit kann auch im klassischen „Eberwein“ Prozess eingesetzt werden.

Die IVT Kits von Biozym liefern eine schnellere und höhere Ausbeute an RNA als die „High-Yield“-Kits der Wettbewerber.

Die angegebenen Ausbeuten beziehen sich auf ein 1,4 kb RNA-Transkript, das unter Verwendung von 1 μg eines linearen DNA-Template in einer 20-μl-Reaktion, gemäß dem empfohlenen Protokoll des Herstellers synthetisiert wurde.

Das DuraScribe® T7 Transcription Kit* ist ein IVT Kit, das RNA produziert – sogenannte DuraScript® RNA – die vollständig resistent gegen RNase A-Verdau ist.
Das DuraScribe T7 Transcription Kit enthält die DuraScribe T7 RNA Polymerase, eine verbesserte Formulierung der Y639F-Mutante1 der T7 RNA Polymerase, die effizient aus 2´-Fluorin-CTP (2´-F-dCTP), 2´-Fluorin-UTP (2´- F-dUTP), ATP und GTP in RNase-resistente RNA-Transkripte namens DuraScript RNA, synthetisiert. Die DuraScribe T7-RNA-Polymerase verwendet die gleichen T7-Promotoren wie die Wildtyp T7 RNA Polymerase.
Diese RNase A-resistente RNA eignet sich perfekt für die RNA-Aptamer-Synthese sowie Antisense-RNA- und RNA-Interferenz (RNAi)-Experimente.

Herstellung von RNA mit Cap

Es gibt zwei Arten von Capping-Systemen.

1. Co-Transkriptional: Das Cap wird während der in vitro Transkription (IVT) angebaut

Das MessageMAX™ T7 ARCA-Capped Message Transcription Kit produziert in vitro transkribierte gecappte RNA unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase und dem Anti-Reverse-Cap-Analogon (ARCA) m27,3'-OG[5']ppp[5']. Eine 30 Minuten, 20 μl MessageMAX-Reaktion ergibt bis zu 60 μg ARCA-gekappte RNA aus nur 1 μg der 1,4 kb Standard-T7-Kontroll-Template DNA.

Da das ARCA eine 3'-O-Methylgruppe am m7G-Nukleotid enthält, kann dieses Cap im Gegensatz zu einem Standard Cap nur in der richtigen Orientierung am 5'-Ende der RNA während einer in vitro-Transkriptions-/Capping-Reaktion eingebaut werden.

2. Das Cap wird separat nach der in vitro Transkription (IVT) angebaut

Das T7 mScript™ Standard mRNA-Produktionssystem bietet Ihnen alle Enzyme und enzymbezogenen Reagenzien zur Herstellung von 5'-gecappter, 3'-polyadenylierter mRNA.

Das T7 mScript™ Standard mRNA-Produktionssystem enthält Module für:

• in vitro Transkription von linearen doppelsträngigen DNA-Templates mit der mScript T7 Enzymlösung und die kanonischen Nukleotide ATP, CTP, GTP und UTP
• enzymatisches Capping der RNA mit ScriptCap™ Capping Enzyme System (zur Herstellung von mRNA mit einer Cap-0-Cap-Struktur)
• ScriptCap™ 2'-O-Methyltransferase (zur optionalen Herstellung von mRNA mit einer Cap-1-Cap-Struktur)
• A-Plus™ Poly(A) Polymerase zum Hinzufügen eines 3'-Poly(A)-Tails.

Nach der Transfektion hat gecappte und mit einem PolyA-Tail versehene mRNA in den meisten Fällen eine höhere Stabilität und damit auch höhere Translationseffizienz in eukaryotischen Zelllinien als nicht modifizierte RNA. Das mScript-System hat gegenüber anderen Capping-Methoden den Vorteil, dass bei höherer Ausbeute die Capping Effizienz nahezu 100 % beträgt und alle „Cap-Strukturen“ die richtige Orientierung ausweisen.
Diese mRNA eignet sich für Transfektions- und Mikroinjektions-Experimente sowie in vitro Translationssysteme. Die Module sind auch einzeln erhältlich.

Gut zu wissen: Zur RNA-Aufreinigung nach der IVT Reaktion empfehlen wir Ihnen unser auf magnetischen Beads basierendes HighPrep RNA Elite Reagenz. 

Überblick über die erhältlichen Transkriptions- und Capping-Kits

FAQ – Häufig gestellte Fragen zur In vitro Transkription

Wie funktioniert ein Up Scaling der IVT Reaktion mit dem T7 Flash Scribe Kit?

Vergrößern Sie alle Reaktionskomponenten -einschließlich der Template-DNA- proportional. So kann beispielsweise 1 mg eines 1,4 kb-Transkripts in 30 Minuten durch ein 6-faches Scale-up der Standardreaktion von 20 µl auf 120 µl unter Verwendung von 6 µg Kontroll-Template-DNA, hergestellt werden. Sollte nicht genügend DNA-Template vorhanden sein, kann der alles außer dem Template höher skaliert und die Reaktionszeit dementsprechend verlängert werden.

Was ist die Rolle von RNase-Inhibitoren bei der In vitro Transkription?

RNase-Inhibitoren spielen eine entscheidende Rolle bei der In vitro Transkription, da sie die RNA vor dem Abbau durch RNasen schützen. RNasen sind Enzyme, die RNA abbauen können, und ihre Aktivität kann die Ausbeute und Qualität der synthetisierten RNA erheblich beeinträchtigen. Durch den Einsatz von RNase-Inhibitoren wird sichergestellt, dass die RNA während des Transkriptionsprozesses stabil bleibt, was zu einer höheren Effizienz und Reinheit der produzierten RNA führt. Daher ist der RNase-Inhibitor bereits in unseren IVT Kits mit Ausnahme des DuraScribe® T7 Transcription Kits (RNAse A resistente RNA) enthalten.

Was ist der Unterschied zwischen der Cap0 und Cap1 Struktur?

Der Unterschied zwischen Cap 0- und Cap 1-mRNA besteht in der Hinzufügung einer Methylgruppe an der 2'-O-Position des vorletzten (zweiten vom 5'-Ende) Nukleotids des Transkripts. Diese Methylierung ist Teil des natürlichen Capping-Prozesses in höheren eukaryontischen Zellen und verbessert in einigen, aber nicht allen Fällen die In-vivo Translation gegenüber der entsprechenden Cap 0-mRNA. Wenn Sie eine neue Zelllinie oder ein neues Translationssystem verwenden, empfehlen wir, einen Vergleich zwischen der Cap 0- und Cap 1-mRNA-Translationseffizienz durchzuführen, um die optimale Cap Struktur für dieses System zu bestimmen.