Western Blotting

Western Blotting ist eine weit verbreitete Analysetechnik, mit der ein oder mehrere spezifische Proteine in einem komplexen Proteingemisch identifiziert werden können. Es ist ein leistungsstarkes Tool, das Informationen über das Vorhandensein, die Größe und unter den richtigen Bedingungen sogar die Menge eines Proteins liefert.

Unsere Produkte zum Western Blotting

Wir bieten Ihnen ein umfangreiches Portfolio rund ums Western Blotting an:

• Gelelektrophorese-Equipment
• Vorgefärbte Marker – machen den Transfer auf die Membran sichtbar
• Blotter: Wet oder Semi-Dry, Nitrocellulose- und PVDF-Membranen, Transfer-Puffer, Wasch- und Blocking-Lösungen
• Western Blot Detektion: Ponceau- oder Fluoreszenz-Färbung, Chemilumineszenz-Substrate, Fluoreszenzmarkierte Zweit-Antikörper
• Imaging Systeme: Von der einfachen Geldokumentation bis zum hochkomplexen Fluoreszenz- und Chemilumineszenz-Detektor

Unsere breite Produktpalette unterstützt jeden Schritt des Western Blot, von der Auftrennung der Proteine bis zur präzisen Western Blot Auswertung.

Gut zu wissen: Entdecken Sie auch unsere praktische Inkubationsbox für das Western Blotting.

Western Blot Analyse: Die einzelnen Schritte

Obwohl Western Blotting in vielen Laboren häufig eingesetzt wird und Routine ist, kann es frustrierend sein, wenn es nicht funktioniert. Der Schlüssel zu den besten Western Blot liegt darin, den Prozess zu verstehen. Nachfolgend finden Sie eine kurze Übersicht über jeden Schritt.

Von der Gelelektrophorese zur Western-Blot-Detektion

Die Gelelektrophorese ist der erste Schritt in der Western Blot Analyse, bei dem Proteine über eine Gelmatrix physikalisch voneinander getrennt werden (Abbildung 1.1). Die Proteinprobe wird mit einem Ladepuffer gemischt, auf das Gel geladen und dann einem elektrischen Strom ausgesetzt. Die z. B. unter den Versuchsbedingungen im SDS-Puffer negativ geladenen Proteine wandern durch das Gel zur positiven Elektrode.

Abbildung 1.1. Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Abhängig von der Art des Gels und dem verwendeten Puffersystem wird die Distanz, die ein Protein durch die Gelmatrix wandert, hauptsächlich durch das Masse-Ladungs-Verhältnis des einzelnen Proteins oder einfach durch das Molekulargewicht des Proteins bestimmt.

Western Blotting – Auf die Membran übertragen

Nach der elektrophoretischen Trennung der Proteine durch das Gel werden die Proteine für die nachfolgenden Schritte auf einen festen Membranträger übertragen. Ein effizienter Transfer hängt dabei von mehreren Faktoren ab:

• Wahl der Membran,
• Art der verwendeten Transfervorrichtung,
• Zusammensetzung des Transferpuffers.

Der erfolgreiche Transfer von Proteinen beruht sowohl auf der Migration von Proteinen aus dem Gel als auch auf der Retention von Proteinen auf der Membran. Wie bei der Gelelektrophorese nutzt der Transferschritt in der Western Blot Analyse Elektrizität, um negativ geladene Proteine zur positiv geladenen Elektrode zu bewegen (Abbildung 1.2).

Abbildung 1.2. Ein typischer Semi-Dry Transferaufbau

Semi-Dry Blot: Transferstapel für das Western Blotting

Zu den üblicherweise für Western Blotting verwendeten Membranen gehören Nitrozellulose (NC) und Polyvinylidendifluorid (PVDF). Pufferkomponenten werden basierend auf folgenden Faktoren optimiert:

• Art des verwendeten Transfersystems (Wet oder Semi-Dry)
• Art des verwendeten Gels,
• der Wahl der Membran,
• dem interessierenden Protein.

Übertragungszeiten und Spannungseinstellungen sollten für jeden Transfer optimiert werden.

Während Proteine bei höheren Spannungen im Allgemeinen schneller übertragen werden, ist die Übertragungseffizienz nicht immer konstant. Ein unzureichender Strom und/oder eine unzureichende Zeit können zu einem unvollständigen Transfer führen, wohingegen ein hoher Strom und/oder lange Transferzeiten zum Verlust von Proteinen durch den Transfer durch die Membran ohne Retention führen können. Zur Überprüfung des erfolgreichen Transfers beim Western Blotting kann AdvanStain Ponceau oder SYPRO Ruby Protein Blot Farbstoff eingesetzt werden.

Membranblockierung

Um das Hintergrundsignal so gering wie möglich zu halten, wird die Membran nach dem Transfer in einer Blockierungslösung inkubiert, um eine unspezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern. Die Optimierung der Blockierungsbedingungen ist wichtig, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten, insbesondere, wenn quantitative Informationen gewünscht sind. Es stehen verschiedene Arten von Blockierungsmitteln zur Verfügung, und die Blockierungslösung sollte für jede Antikörper-Antigen-Wechselwirkung optimiert werden:

• Für Chemilumineszenz Detektion: AdvanBlock-Chemi-blocking Solution
• Für Fluoreszenz Immunoblots: Immunoblot Blocking Lösung AdvanBlock oder AdvanBlock-Fluor 1000 ml Blocking Buffer

Membraninkubation mit Antikörper

Nach dem Blockieren wird die Membran mit primären Antikörpern inkubiert und anschließend werden nicht gebundene Antikörper abgewaschen. Für den direkten Nachweis wird der Primärantikörper mit einer Sonde markiert (Abbildung 1.3). Häufiger wird der indirekte Nachweis bei der Western Blot Analyse verwendet, bei dem der primäre Antikörper unmarkiert ist und ein markierter sekundärer Antikörper an den primären Antikörper bindet (Abbildung 1.3).

Abbildung 1.3. Indirekte vs. direkte Erkennung

Gut zu wissen: Aufgrund der breiten Spezifität des Sekundärantikörpers kann ein Sekundärantikörper zum Nachweis einer Vielzahl von Primärantikörpern verwendet werden, was diese Methode äußerst kosteneffektiv macht.

Antikörpernachweis

Abhängig von der an den Antikörper gebundenen Markierung, kann die Antikörperbindung mithilfe kolorimetrischer, radioaktiver, chemilumineszierender oder fluoreszierender Nachweismethoden sichtbar gemacht werden.

Chemilumineszenz-Western-Blotting: Dieses Vorgehen ist eine beliebte indirekte Nachweismethode, die auf einer Enzym-Substrat-Reaktion beruht, die Licht emittiert (Abbildung 1.4). Meerrettichperoxidase (HRP) und alkalische Phosphatase (AP) sind zwei Enzyme, die häufig zur Markierung von Antikörpern verwendet werden. Die Empfindlichkeit der Chemilumineszenzdetektion hängt von der Wahl des Substrats ab – kommerziell erhältliche Substrate für HRP können Proteine im Femtogrammbereich nachweisen.

Abbildung 1.4 Chemilumineszenz-Western-Blot – ein Signal, ein Protein

Fluoreszenz-Western-Blotting: Bei dieser Nachweismethode werden Antikörper verwendet, die direkt an Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert sind. Im Gegensatz zu chemilumineszierenden Westerns, die durch die variable Kinetik der Enzym-Substrat-Reaktion eingeschränkt sind, ist die von Fluorophoren emittierte Lichtmenge sehr konsistent und direkt proportional zur Proteinmenge auf der Membran. Diese Konsistenz bedeutet, dass die Fluoreszenzdetektion eine wirklich quantitative Analyse der Proteinmenge ermöglichen kann.

Die Fluoreszenzdetektion ermöglicht auch ein Multiplexing, bei dem mehrere Proteine gleichzeitig auf demselben Western Blot nachgewiesen werden können (Abbildung 1.5).

Abbildung 1.5. Multiplex-Fluoreszenz-Western

Auswahl eines Bildgebungssystems für das Western Blotting

Heutzutage ist die Western-Blot-Erkennung nicht mehr auf die Möglichkeiten eines Röntgenfilms in einer Dunkelkammer beschränkt. Auf dem Markt sind viele digitale Blotcycler erhältlich, die eine genaue Quantifizierung einer Reihe von Signalintensitäten bei der Western Blot Analyse ermöglichen.

Azure Imaging Systems

Sowohl die Chemilumineszenz- als auch die Fluoreszenzdetektion sind mit einem CCD-Kamera-basierten Western-Blotting-System wie dem Azure Imaging Systems (dem einzigen Imager auf dem Markt, der Laser für höhere Signale verwendet) einfach umzusetzen. Mittels Photodioden- oder APD+PMT-Detektion lassen sich diese Signale auch mit dem neuen Biomolekularer Imager Azure Sapphire FL dokumentieren.

• Azure 600: Der Azure 600 z.B. bietet Lasertechnologie mit zwei IR-Detektionskanälen, die es dem Benutzer ermöglichen, mehr als ein Protein in einem Assay abzubilden. Es liefert eine genaue und schnelle Chemilumineszenz-Detektion sowie die Empfindlichkeit, den Dynamikbereich und die Linearität, die für die quantitative Western Blotting Analyse erforderlich sind.
• Sapphire FL: Wenn Ihre Studien ein breites Spektrum an Anwendungsanforderungen benötigen, vom Western Blotting über die Bildaufnahme lebender Tiere bis hin zum Phosphor-Imaging, ist der Sapphire FL die beste Wahl. Der Sapphire FL bietet anpassbare und vom Benutzer austauschbare optische Module, Scans mit einer Auflösung von 5-1000 µm, einen Z-Ebenen-Bereich von -1,0 bis +6 mm, 5 Anästhesie-Ausgangsanschlüsse für die Bildgebung lebender Tiere, Chemilumineszenz-Erkennung durch das Chemilumineszenz-Modul und vieles mehr.
• Azure Chemisolo: Eine einzigartige Webbrowser-Oberfläche ermöglicht die Steuerung des chemiSOLO per Telefon, Tablet oder PC, ohne dass zusätzliche Software installiert werden muss. Mit dem neuen chemiSOLO können Sie chemilumineszierende Western Blots einfach und schnell mit Ihrem Telefon, Tablet oder Laptop abbilden – ohne dass zusätzliche Software-Downloads erforderlich sind. Es ist der erste persönliche Blotcycler seiner Art auf dem Markt.