INCOGNITO™ T7 mScript™ Complete psi

INCOGNITO™ T7 mScript™ Complete psi-mRNA Production System

Das INCOGNITO™ T7 mScript™ Complete psi-mRNA-Produktionssystem enthält alle Enzyme und Reagenzien zur Herstellung von mRNA mit extrem geringer Immunogenität, die Pseudouridin (psi) enthält, eine 5'-Cap Struktur und eine 3'-Polyadenylierung hat und einen extrem geringen Gehalt an doppelsträngiger RNA (dsRNA) aufweist. Das Kit enthält Reagenzien für fünf Arbeitsschritte:

1. In-vitro-Transkription linearer doppelsträngiger DNA-Templates mIt einem T7 Promotor unter Verwendung der T7 mScript™ Enzym-Lösung, der kanonischen Nukleotide ATP, CTP, GTP und des modifizierten Nukleotids Pseudouridin-5'-triphosphat (psiTP)
2. enzymatisches Capping der RNA unter Verwendung des ScriptCap™ Cap 1 Capping Systems (enthält sowohl ScriptCap™ Capping Enzym als auch 2'-O-Methyltransferase) zur Herstellung von mRNA mit einer Cap 1-Cap-Struktur
3. A-Plus™ Poly(A) Polymerase zum Hinzufügen eines 3'-Poly(A)-Tails
4. Posttranskriptionelle enzymatische Entfernung von dsRNA unter Verwendung des Min-Immune™ Gold dsRNA Removal Systems
5. 5 M NH4OAc als bequeme RNA/mRNA-Reinigungsmethode

Nach der Transfektion weisen 5'-gecappte mRNA mit Poly(A) Tail in den meisten eukaryotischen Zelllinien eine erhöhte Stabilität und Translationseffizienz auf. Das INCOGNITO™ mScript™ System erzeugt modifizierte mRNA mit einer Capping-Effiziez von nahezu 100 % und einer vom Anwender definierten Poly(A)-Tail-Länge. Das A-Plus™ Poly(A)-Polymerase-Protokoll bietet eine große Auswahl an Poly(A)-Tail-Längen von 150 bis über 300 Basen. Das enthaltene Min-Immune™ Gold dsRNA-Removal System kann dsRNA auf <0,005 % (LLOQ) in der Probe reduzieren, was weniger ist, als mit gentechnisch veränderten mutierten T7-RNA-Polymerasen erreicht werden kann. Durch seine ultra-niedrige Immunogenität eignet sich das INCOGNITO™ Complete psi-mRNA für den Einsatz in nachgelagerten Anwendungen wie der Zell- und Gentherapieforschung und der Entwicklung von mRNA-Impfstoffen.

Was ist der Unterschied zwischen Cap 0-RNA und Cap 1-RNA?

Abbildung 1: Cap 0-RNA und Cap 1-RNA. Cap 0 wird mit ScriptCap™ Capping Enzyme hinzugefügt und mit 2'-O-Methyltransferase in Cap 1 umgewandelt.

5'-Capping erhöht die mRNA-Stabilität und Translationseffizienz in Zellen im Vergleich zu uncapped RNA, wobei die Cap-1-Methylierung die Translationseffizienz in vivo weiter steigert.

Die Vorteile zusammengefasst:

• Geringere Immunogenität: Synthetisieren Sie Transkripte mit N1me psiTP und niedrigem dsRNA-Gehalt für eine reduzierte Immunantwort.
• Komplettlösung: Kombinieren Sie Transkription, 5'-Capping, 3'-Tailing und dsRNA-Entfernung in einem System.
• Hocheffizientes Capping: Erreichen Sie ~100 % 5'-Cap-1-Capping.
• Anpassbares Poly(A)-Tailing: Erstellen Sie variable 3'-Poly(A)-Tail-Längen von 50 bis >300 Basen.
• Effektive dsRNA-Entfernung: Eliminiert dsRNA auf <0,005 % (LLOQ) der Probe.

Das Produkt ist nur für Forschungszwecke bestimmt (RUO).

Nutzungs- und Labellizenzen für bestimmte Produkte: Der Käufer erhält ein beschränktes, nicht exklusives, nicht übertragbares Recht, die von CELLSCRIPT™ gekauften Produkte ausschließlich für eigene interne Forschungszwecke im Labor zu nutzen. Weitere Informationen finden Sie unter Label License: www.cellscript.com/terms-conditions/

Mitgelieferte Materialien:

Wichtig Bei -20 °C in einem Gefrierschrank ohne Abtaufunktion lagern. Nicht bei -70 °C lagern.

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INCOGNITO™ T7 mScript™ Complete ?-mRNA Production System Kit Contents
25 Reactions.
(Module 1 of 5)

In Vitro Transcription

Kit Component    Reagent Volume

• T7 mScript™ Enzyme Solution    50 µl
• 10X T7 mScript™ Transcription Buffer II    50 µl
• 100 mM Dithiothreitol (DTT)    50 µl
• ?TP PreMix
• 25 mM each GTP, ATP, ?TP, CTP    180 µl
• RNase-Free DNase I, 1 U/µl    25 µl

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INCOGNITO™ T7 mScript™ Complete ?-mRNA Production System Kit Contents
25 Reactions
(Module 2 of 5)

Post-Transcriptional Capping

Kit Component / Reagent Volume

• ScriptCap™ Capping Enzyme, 10 U/µl    100 µl
• ScriptCap™ 2'-O-Methyltransferase, 100 U/µl    100 µl
• 10X ScriptCap™ Capping Buffer
• 0.5 M Tris-HCl (pH 8.0), 60 mM KCl and 12.5 mM MgCl2    250 µl
• 20 mM S-adenosyl-methionine (SAM)    125 µl
• 20 mM GTP    125 µl

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INCOGNITO™ T7 mScript™ Complete ?-mRNA Production System Kit Contents
25 Reactions
(Module 3 of 5)

Kit Component / Reagent Volume

• Poly(A) Tailing    A-Plus™ Poly(A) Polymerase, 4 U/µl    130 µl
• 10X A-Plus™ Poly(A) Tailing Buffer
• 0.5 M Tris-HCl (pH 8.0), 2.5 M NaCl and 100 mM MgCl₂    300 µl
• 20 mM ATP 150 µl

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INCOGNITO™ T7 mScript™ Complete ?-mRNA Production System Kit Contents
25 Reactions
(Module 4 of 5)

Kit Component    Reagent Volume

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 T7-Kontroll-Template-DNA: Ist ein linearisiertes 4,1-kb-Plasmid, das einen T7-Promotor gefolgt von einem Phagen-Lambda-dsDNA-Insert enthält, das ein 1.375 Basen langes Runoff-Transkript kodiert. Die Kontroll-Template-DNA wird in einer Konzentration von 0,5 µg/µl in T10E1-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) bereitgestellt.

Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien

• Eine DNA-Matrize für die Transkription Ihrer RNA von Interesse
• Materialien oder Kits zur Reinigung der in Vitro transkribierten RNA-Produkts, wenn Sie nicht das mitgelieferte Kit verwenden NH4OAc
• RNase-freier TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) nur für die endgültige mRNA-Resuspension, wenn Sie nicht das mitgelieferte Kit verwenden RNase-freies Wasser
• 70 % Ethanol

Optionale Materialien

• dsRNA-spezifisches Nachweissystem, einschließlich:
• dsRNA-spezifischer Antikörper (z. B. J2-Antikörper [Absolute Biotech-Exalpha])
• Dot/Slot-Blotting-System zur Verwendung mit dem Antikörper
• Ein Bildanalysegerät zur Visualisierung und/oder Quantifizierung des Blots
• dsRNA-Standards
• TE-gesättigtes Phenol/Chloroform, 0,5–1 M EDTA