Die Firma BioThema entwickelt seit über 30 Jahren Produkte für analytische Anwendungen der Firefly (Glühwürmchen) Luciferase-Reaktion, sei es beispielsweise zum Nachweis von Zellen oder der Messung der Enzymaktivität. Bei dieser Reaktion wird Luciferin mit ATP (Adenosintriphosphat) aktiviert und anschließend zu Oxyluciferin und CO2 oxidiert. Das Oxyluciferin wird in einem angeregten Zustand gebildet und emittiert Licht, wenn es in seinen Grundzustand übergeht. Das Licht kann dann in einem Luminometer gemessen werden.
ATP+Luciferin+O2—Luciferase—>AMP+Pyrophosphat+Oxyluciferin+CO2+Licht
Bei ATP-Assays, die auf der Firefly Luciferase-Reaktion basieren, kann die Lichtemission im Wesentlichen konstant sein oder schnell abnehmen. Es gibt daher verschiedene ATP-Reagenzien: „Stable Light“ und „Flash-Type“. Bei niedrigen Luciferase-Spiegeln wird ein vernachlässigbarer Anteil des ATP pro Minute verbraucht und die Lichtemission kann dann fast konstant, aber auch gering sein. Bei hohen Luciferase-Konzentrationen ist es unvermeidlich, dass ATP verbraucht wird, was zu einer schnell abnehmenden Lichtemission führt, anfangs ist der Emission-Peak jedoch hoch. Tatsächlich sind sowohl die Peakhöhe als auch die Zerfallsrate proportional zur Luciferaseaktivität. BioThema hat drei Arten von ATP-Reagenzien entwickelt:
- ATP Reagenz SL (stable light) mit einer Zerfallsrate <1 %/min.
Wenn diese Reagenzien zu einem Reaktionsgemisch gegeben werden, in dem ATP gebildet oder abgebaut wird, kann die ATP-Konzentration kontinuierlich überwacht werden, indem die Lichtemission gemessen wird. ATP Reagenz SL kann auch verwendet werden, um ATP in kultivierten eukaryotischen Zellen (z. B 20 fmol ATP/Zelle) zu messen. Der linearere Bereich des Assays beträgt 1-50.000 Zellen. - ATP Reagenz HS (High Sensitivity) mit einer Zerfallsrate von 10 %/min.Dieses Reagenz enthält die 20-fache Aktivität von ATP Reagenz SL und dient hauptsächlich zum Nachweis geringer Bakterienkonzentrationen. Bakterienzellen enthalten etwa 1 amol ATP pro Zelle. Mit ATP Reagenz HS können 10 amol ATP nachgewiesen werden, was etwa 10 Bakterienzellen entspricht. Ein gutes Luminometer verfügt über einen linearen Bereich von 10-100.000 amol ATP. Dieses Reagenz kann manuell in die Probe injiziert werden, da das Einsetzen der Küvette in das Luminometer und die Messung des Lichtsignals nur wenige Sekunden dauert.
- ATP-Reagenz SS (Super Sensitive) mit einer Zerfallsrate um 235% / min und 235x so viel Luciferase wie ATP-Reagenz SL. Nach 1 Minute bleiben nur noch 10 % des Lichts übrig. Dies bedeutet, dass das Reagenz in die Probe injiziert werden muss, um das Signal zu erfassen. Die Nachweisgrenze mit diesem Reagenz liegt bei <1 amol ATP (Berthold Detection Systems, Application Note 2010/10). Bei solchen ATP-Werten findet man ATP-Kontaminationen auf Pipettenspitzen, Mikrotiterplatten und überall. Dieses Reagenz sollte verwendet werden, wenn eine wirklich hohe Sensitivität erforderlich ist.
Das Lichtsignal wird normalerweise in Relative Light Units (RLU) ausgedrückt. Diese Einheiten variieren zwischen Instrumenten, Reagenzien und Probenmatrizen und mit der Temperatur. Es ist daher notwendig, jeden Assay zu kalibrieren, indem das Lichtsignal vor und nach der Zugabe einer bekannten Menge an ATP-Standard gemessen wird. BioThema verfügt über eine Reihe zertifizierter flüssigkeitsstabiler ATP-Standards. Sie sollten in einem kleinen Volumen (10 µl) zugesetzt werden, um die Reaktionsbedingungen nicht zu verändern. Die Menge sollte mindestens das 10-fache der ATP-Menge der Probe betragen. Die Verwendung von ATP-Standards kompensiert auf diese Weise alle Arten von analytischen Störungen und es werden immer korrekte Ergebnisse erhalten. Dies ist nicht der Fall, wenn Sie sich auf eine ATP-Standardkurve beziehen, da es zu Störungen durch die Probenmatrix und Schwankungen der Probentemperatur kommen kann.
Die oben genannten ATP-Reagenzien und ATP-Standards werden mit verschiedenen anderen Reagenzien zu einer Reihe von Kits für spezielle Anwendungen kombiniert.
Diese Reagenzien umfassen:
- ATP-Eliminierungsreagenz zum Abbau von extrazellulärem ATP bei der Bestimmung von intrazellulärem ATP.
- Zelllysierungsreagenz zur Lyse von somatischen Zellen, die Bakterienzellen bleiben intakt.
- Extraktionsmittel B/S zur Freisetzung von Adeninnukleotiden aus Bakterien- und Körperzellen.
- Luciferin-Substrat und ATP-Substrat für Assays von Firefly Luciferase.
- D-Luciferin (freie Säure, Kaliumsalz und Natriumsalz) für die In-vivo-Bildgebung.
Empfohlene Übersichtsartikel:
Lundin, A. (2000) Use of Firefly Luciferase in ATP-Related Assays of Biomass, Enzymes, and Metabolites. Methods in Enzymology, 305, 346-370.
Lundin A. (2014) Optimization of the firefly luciferase reaction for analytical purposes. Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 2014; 145:31-62”
