DNA-Gelelektrophorese

Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine der am häufigsten durchgeführten biowissenschaftlichen Labortechniken. Sie wird z.B. zur Auftrennung biologischer Moleküle nach ihrer Größe verwendet. Dies ist für eine Reihe von Forschungsanwendungen sehr nützlich, z. B. bei der Identifizierung unbekannter Proben im Vergleich zu bekannten Ergebnissen oder bei der Durchführung von Qualitätskontrollen.

Agarose-Gelelektrophorese wird am häufigsten zur Auftrennung von DNA-Molekülen verwendet. Im Folgenden stellen wir nur einige der Anwendungen der Agarose-Gelelektrophorese von DNA vor, d.h. wie sie funktioniert und welche Ausrüstung zur Durchführung der Technik erforderlich ist.

Klonierung (Molecular Cloning)

Eine häufige Anwendung der Agarose-Gelelektrophorese ist die Klonierung (Molecular Cloning). Bei der Klonierung wird ein näher zu betrachtendes DNA-Fragment (z. B. ein Gen oder die für ein Protein codierende cDNA) in einen Vektor (z. B. ein Plasmid oder viraler Vektor) integriert. Das Ziel der Klonierung ist es, dieses DNA-Fragment zu vermehren, um seine Eigenschaften zu untersuchen oder es gegebenenfalls in Folgeprozessen weiterzuverwenden.

In der Biotechnologie wird diese Methode z.B. für therapeutische Zwecke (Herstellung von Insulin), für die Verwendung in der Lebensmittelindustrie (Herstellung von Lab-Ferment) oder zur Generierung gentechnisch verändertes Organismen in der Landwirtschaft genutzt.

Was auch immer das gewünschte Endprodukt ist, die Elektrophorese ist ein wichtiger Schritt sowohl bei der Herstellung der Klone als auch bei der Qualitätskontrolle. Elektrophorese kann verwendet werden, um die durch PCR oder Restriktionsverdau erzeugten Fragmente zu analysieren und um sicherzustellen, dass sie die richtige Größe haben. Die im Gel aufgetrennten Fragment können aber auch ausgeschnitten und für weitere Prozesse aufgereinigt werden.

PCR-Vorbereitung und Gelelektrophorese 

Genetischer Fingerabdruck

In Kombination mit der PCR kann die Agarose-Gelelektrophorese eine leistungsstarke Technik zur Identifizierung von Personen anhand ihres genetischen Codes sein. Das menschliche Genom enthält viele Regionen mit kurzen Wiederholungen, deren Anzahl von Individuum zu Individuum unterschiedlich ist (VNTR (variable number of tandem repeats) oder STRs (Short tandem repeats). Von diesen nicht codierenden Bereichen werden zurzeit ca. 8-15 Abschnitte in der PCR amplifiziert. Auf dem anschließenden Elektrophoresegel wird ein Bandenmuster sichtbar, das für jedes Individuum quasi einzigartig ist. Diese als DNA-Fingerprinting bekannte Technik kann in Bereichen wie der Forensik, für kriminalpolizeiliche Ermittlungen, Genealogie und Abstammungstests eingesetzt werden.

Ausrüstung für die Agarosegelelektrophorese

Die Popularität der Agarose-Gelelektrophorese ist zum Teil auf ihre Einfachheit zurückzuführen. Die erforderliche Ausrüstung ist einfach zu bedienen und erfordert nur wenig Schulung, um richtig zu funktionieren.

Die Gelkammer

Der Geltank ist die Hauptkomponente des horizontalen Agarose-Gelelektrophoresesystems. Im Allgemeinen besteht er aus einem Kunststoffbehälter mit einer erhöhten Plattform in der Mitte, auf der das Gel mit dem Gelträger platziert wird. An beiden Enden des Tanks sind Elektroden aus einem inerten leitfähigen Material, in der Regel Platin, befestigt und mit den Anschlüssen der Kammer verbunden, um die Stromversorgung zu ermöglichen. Schließlich sitzt ein Deckel auf dem Geltank, um den Zugang zur Kammer zu verhindern, während die Hochspannung an den Puffer angelegt wird.

Abbildung: Schema einer Gelkammer mit allen Komponenten.

PowerSupplies - für die richtige Spannung sorgen:

Hier gelten die folgenden Faustregeln, wobei die „cm“ sich auf den Abstand der Elektroden beziehen:

• Auftrennung von Fragmenten < 1 kb bei ca. 5 V/cm* in TBE Puffer (TAE Puffer für Rückgewinnung der Probe)
• Auftrennung von Fragmenten von 1 kb-12 kb bei ca. 4-10 V/cm* in TBE oder TAE Puffer (TAE Puffer für Rückgewinnung der Probe)
• Auftrennung von Fragmenten von > 12 kb bei ca. 1-2 V/cm* in TAE Puffer

Zu den Spannungsgebern

Welche Agarose benötige ich für meine Anwendung?

Habe ich größere Fragmente, die aufgetrennt werden müssen oder sind die Fragmente klein und liegen die Banden dicht beieinander?

Aufgrund der Vielzahl unterschiedlicher Fragestellungen ist es den Molekularbiologen heute jedoch kaum mehr möglich mit nur einer Agarose auszukommen. Die folgenden Punkte sollten daher bei der Wahl der richtigen Agarose berücksichtigt werden:

• Anzahl Basenpaare oder Nukleotide der zu trennenden Probe?
• Analytische oder präparative Auftrennung erforderlich?
• In-Gel Techniken (Ligation, Transformation aus der Gelschmelze) erwünscht?
• Spezielle Verfahren wie PFGE, PCR-Screening, Blotting, Fingerprinting etc. benötigt?
• Einsatz in der Laborroutine (DNA-Fertiggel)?

Wählen Sie die richtige Agarose für Ihre Anwendung

Antworten auf diese Fragen und weitere Informationen zur Auswahl der richtigen Agarose und des passenden Puffers finden Sie hier

Farbstoffe

Transilluminator mit Blue/Green LED Technologie

Passend zu den Blaulichtfarbstoffen bietet sich für die Betrachtung der Ergebnisse die Verwendung eines Transilluminators mit blaugrünen LED an. Im Vergleich zur Anregung mit UV-Licht erreicht man mit dieser Technologie eine höhere Signalintensität, da der Anregungsbereich mit 470 bis 520 nm deutlich weiter gefasst ist. Neben grünen Farbstoffen, wie z.B. Midori Green und GelStar®, können daher auch rote Nukleinsäure Farbstoffe wie z.B. Ethidiumbromid (EtBr) und GelRed™ visualisiert werden.

Weitere Informationen finden Sie hier.

Wenn Sie Ihre DNA- bzw. RNA-Gele nicht nur anschauen, sondern auch dokumentieren und auswerten möchten, dann empfehlen wir Ihnen die Azure 200 Gel Documentation Workstation.