Protein-Gelelektrophorese
Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ist eine universelle Technik, die in vielen Life-Science-Laboren verwendet
wird. Das Ziel ist es, eine gemischte Proteinprobe zu trennen und einzelne Proteine aus dieser Mischung zu identifizieren und zu quantifizieren. Die Ausgangsprobe kann aus einer beliebigen Anzahl von Quellen stammen, wie z. B. einer Patientenprobe, homogenisiertem Gewebe oder einer Bakterienkultur. Es ist auch möglich, PAGE zur Trennung von DNA und RNA zu verwenden, aber Proteine sind der häufigste Probentyp.
PAGE wird oft mit dem Western Blotting kombiniert. Die im Blotting verwendeten Antikörper binden an spezifische Proteinantigene und ermöglichen es einzelne Proteine mit hoher Spezifität zu identifizieren.
Wie funktioniert es?
Es gibt mehrere Arten von PAGE-Techniken, die verwendet werden, aber die gebräuchlichste heißt SDS-PAGE. Bei der SDS-PAGE wird das Detergens Natriumdodecylsulfat verwendet, um die Proteine zu denaturieren und ihr Masse-Ladungs-Verhältnis zu normalisieren. Ohne SDS würden sowohl das Molekulargewicht als auch die Ladung des Proteins seine Trennung im Gel beeinflussen. Bei SDS beeinflusst nur das Molekulargewicht die Migrationsgeschwindigkeit und so trennen sich die Proben entsprechend. PAGE ohne SDS wird als native PAGE bezeichnet, da die Proteine in ihrer nativen Konformation bleiben.
Die Gelmatrix
Wie bei der Agarose-Gelelektrophorese werden die Proben durch ein elektrisches Feld getrennt und passieren eine Gelmatrix, die die Wanderung der Proteine beeinflusst. In der PAGE verwenden wir anstelle von Agarose Polyacrylamid. Durch Variieren des Polyacrylamidanteils im Gel können wir die Größe der Poren im Gel verändern, so dass wir unterschiedliche Proteingrößen auftrennen können. Typische Prozentigkeiten sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt.
| Acrylamidkonzentration % |
Trennbereich |
| 5 % | 60 – 220 KDa |
| 7,5 % | 30 – 120 KDa |
| 10 % | 20 – 75 KDa |
| 12 % | 17 – 65 KDa |
| 15 % | 15 -45 KDa |
| 17,5 % | 12 – 30 KDa |
Acrylamid wird normalerweise in flüssiger Form verkauft, da die Pulverform neurotoxisch und gefährlich in der Handhabung ist. Die Polymerisation wird durch Mischen von Acrylamid mit Bisacrylamid erreicht, wodurch sich Vernetzungen zwischen den Acrylamidmolekülen bilden. Zusätzliche Chemikalien werden hinzugefügt, um die Polymerisation zu initiieren, normalerweise Ammoniumpersulfat als Quelle für freie Radikale und TEMED als Stabilisator. Sobald die Polymerisation beginnt, wird das Gel zwischen zwei Glasplatten gegossen und kann dort vollständig auspolymerisieren.
Die Gelmischung wird nicht in Wasser, sondern in Elektrophoresepuffer (Tris-HCl) angesetzt, der die Ionen für die Elektrophorese liefert. Oft wird das Gel in zwei Teilen gegossen. Der erste Teil ist ein Trenngel, welches eine für die Probe sinnvolle Porengröße hat (pH-Wert ca. 8,8). Oberhalb des Trenngels wird ein Sammelgel mit einem pH-Wert von 6,8 und einer größeren Porengröße gegossen. Dieses Sammelgel komprimiert die Proteinproben zu einer dünnen Migrationsfront, sodass alle Proteine in der Probe gleichzeitig am Trenngel ankommen, was zu einer genauen relativen Migration führt.
Der Geltank ist ebenfalls in zwei Abschnitte unterteilt. Je nach Hersteller hat der Tank eine innere (oder obere) Pufferkammer und eine äußere (oder untere) Pufferkammer. Diese beiden Kammern werden durch das Gel verbunden, um einen kontinuierlichen Kreislauf zu schaffen. Jede Kammer enthält eine Elektrode, negativ in der inneren Kammer und positiv in der äußeren Kammer. Die innere Kammer berührt die Oberseite des Gels, und wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, bewegen sich die Proteine aufgrund der negativen Ladungen der SDS-Moleküle in Richtung der positiven Elektrode in der äußeren Pufferkammer. Typische Puffer für SDS-PAGE sind Tris-Glycin für die Pufferkammern und Tris-HCl für das Gel.
Die Bewegungsgeschwindigkeit durch das Gel wird dann durch den Spannungsgradienten bestimmt, also die Spannung zwischen den Elektroden. Die erforderliche Feldstärke hängt von der Größe des verwendeten Geltanks ab und die erforderliche Spannung kann mit der einfachen Gleichung E = V/d berechnet werden, wobei „E“ die Feldstärke, „V“ die Spannung und „d“ der Abstand in cm zwischen den Elektroden ist. Vertikale Geltanks werden im Allgemeinen mit 5 – 10 V/cm betrieben. Wenn Ihr Tank also einen Elektrodenabstand von 10 cm hat, würden Sie das Gel mit 50 – 100 V betreiben. Der genaue Wert hängt von Ihren Proben ab und sollte empirisch ermittelt werden.
Schema einer Gelkammer mit allen Komponenten
In der folgenden Tabelle finden Sie die wichtigsten Daten der verfügbaren Kammer-Modelle der Biozym EasyPhor PAGE Reihe:
|
EasyPhor System |
Mini  |
Mini Wide  |
Maxi WAVE  |
|
Außenmaße |
19x13x15 cm |
26x16x16 cm |
30x18x27 cm |
|
Gelgrößen (Plattengröße) |
8x8,5 cm |
18x8 cm |
16x17,5 cm |
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Max. Probenkapazität |
80 Proben |
192 Proben |
192 Proben |
|
Puffervolumen |
Min. 250 ml, |
Min. 600 ml, |
Min. 1200 ml, |
|
Typ. Laufbedingungen |
90-125 V, |
125 V, |
250 V, |
|
Kühlung |
über Kühlpacks |
über Kühlpacks |
Kühlschlange, Anschluss an Umwälzpumpe möglich |
|
Kapazität |
1-4 Gele |
1-4 Gele |
1-4 Gele |
Um dieses elektrische Feld anzulegen, verwenden wir eine Gleichstromversorgung. Die meisten Elektrophorese-Netzteile können so eingestellt werden, dass sie entweder einen konstanten Strom oder eine konstante Spannung liefern, wobei beides Vor- und Nachteile hat. Ein mögliches Problem ist die Wärmeerzeugung aufgrund des Stromflusses durch das System, der bei größeren Tanks, die eine höhere Spannung erfordern, besonders hoch sein kann. Aus diesem Grund ist es ratsam, bei größeren Elektrophoresesystemen eine Form der Kühlung zu verwenden, entweder passiv mit Hilfe eines Kühlblocks oder aktiv mit z. B. einem Umlaufkühler.
Visualisierung des Proteins
Nach der Migration müssen Proteine sichtbar gemacht werden, um z.B. ihre Länge und Häufigkeit zu bestimmen. Es gibt sowohl spezifische als auch unspezifische Methoden, Proteine sichtbar zu machen.
Die unspezifische Proteinvisualisierung zielt auf alle Proteine ab. Hier werden Farbstoffe verwendet, die an gemeinsame Regionen der Proteine wie die Aminogruppen binden. Beispiele für unspezifische Proteinfarbstoffe sind AdvanStain Scarlet, Visio Real-time Protein Stain, Coomassie Brilliant Blue und SYPRO Ruby. Diese Färbungen sind oft nicht reversibel und können (aber nicht immer) nachfolgende Anwendungen beeinträchtigen. Eine unspezifische Färbung kann aber nützlich sein, um Proben in einem Gel schnell zu quantifizieren oder um sicherzustellen, dass eine interessierende Probe vorhanden ist.
Um bestimmte Proteine sichtbar zu machen oder auch zu quantifizieren, werden Western Blotting und Proteindetektion mittels spezifischer Antikörper durchgeführt.
Unabhängig davon, ob Sie Western Blotting oder nur eine unspezifische Färbung durchführen, müssen Sie die Proteine mit einem Geldokumentationssystem visualisieren. Die Art des verwendeten Systems hängt davon ab, ob Sie einen sichtbaren Farbstoff wie Coomassie oder einen an einen Antikörper gebundenen Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Farbstoff verwenden. Wie bei Agarose-Geldokumentationssystemen können Geldokumentationssysteme für Proteine je nach Anforderung in einer Vielzahl von Spezifikationen erhältlich sein.
